实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解

时间：2023-06-02 11:18:01 | 来源：网站运营

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实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解：


CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基本原理是，Cas9 蛋白与人工设计的 sgRNA 结合成为 sgRNA-Cas9 蛋白复合体并在其引导之下结合到特定的核苷酸序列切割目标 DNA分子造成双链断裂，细胞内非同源末端连接的方式（NHEJ）造成断裂位点随机插入、删除等突变。CRISPR/Cas9 系统通过这种方式引入特定位点的突变。实验笔记丨CRISPR-dCas9实验步骤详解
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基本原理是，Cas9 蛋白与人工设计的 sgRNA 结合成为 sgRNA-Cas9 蛋白复合体并在其引导之下结合到特定的核苷酸序列切割目标 DNA分子造成双链断裂，细胞内非同源末端连接的方式（NHEJ）造成断裂位点随机插入、删除等突变。CRISPR/Cas9 系统通过这种方式引入特定位点的突变。




dCas9 是通过抑制Cas9 核酸酶的 RuvC 和 HNH 两个结构域的活性来得到的，在此之后得到的 dCas9 系统只有结合基因组序列的能力却没有在基因组序列上切割的能力。CRISPR /dCas9 系统分别 融 合 一 个 激 活 元 件 或 一 个 抑 制 元 件 时 会 产 生 基 因 激 活 或 者 抑 制 的 功 能 。随着dCas9 发现和应用的成熟，CRISPR-dCas9 系统应运而生，逐渐成为科学家分子生物学用于激活和抑制基因表达研究的新工具。




sgRNA 的设计




sgRNA，单链引导 RNA，作为 CRISPR/Cas9 系统中 cas 蛋白的引导序列，可参照 sgRNA 工具网站(http://crispr.mit.edu)设计多条 sgRNA 以降低脱靶率。




sgRNA 质粒的构建方法




1）用 BbsI 在 37℃条件下酶切载体质粒 pAC1371。




2）琼脂糖凝胶电泳，切胶用 DNA 片段回收试剂盒回收目的载体片段




3）引物退火




使用以下参数在 PCR 环仪中进行退火:





37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低 5℃的速度将温度降到 25℃




4）连接酶连接。




5）质粒转化（Transformation）

A）取一支储存在-80℃的 DH5a 感受态细胞放在冰盒里解冻（切不可用手直接握住感受台细胞底部），解冻后将 5-10µL 连接产物加入到感受态细胞中，用枪头轻柔吹混匀（切不可剧烈震荡吹打），在冰盒里静置孵育 25-30 分钟。




B）冰上孵育后将感受态细胞放在提前调节温度至 42℃水浴锅中热激 90 秒。重新转移冰盒里静置孵育 5-10 分钟。




C) 加入 500μL 提前预热至室温的液体培养基，置于 37℃摇床中复苏摇菌 1 小时。




D）3000 转离心 3 分钟，弃掉部分上清液，用灭菌冷却至室温的玻璃棒涂板，置于 37℃培养箱中过夜生长。




6）随机挑取独立生长的菌斑于液体培养基中培养 6-8 小时，进行菌落 PCR。




7）将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像仪成像，选取阳性菌落送去测序公司进行测序鉴定。




8）根据测序结果选取目的菌落扩大培养，提取质粒，备后续实验室用。




脂质体转染细胞




1）准备：细胞准备，将长势良好 HEK293T 细胞按一定数量传代，如：六孔板 1.5*10⁶/孔，传代时培养基需预热。




2）将长势良好，密度适当的 HEK293T 细胞更换一半新鲜培养基（培养基需要预热，更换培养基时，轻柔操作，不要将贴壁生长的 HEK293T 细胞吹起来）。




3）pMD2.G: 1µg+paspax2: 1µg +transgene: 2µg+optimem: 0.125mL 混匀，室温静置5 分钟， lipofectamine 2000：8µL+optimem: 0.125mL 混匀，室温静置 5 分钟。




4）5 分钟后将步骤 2 中的两种混合物混合在一起，轻柔混匀，室温静置 15 分钟。




5）将 3）中混合物加入 6 孔板中，每孔加 250µL（加样时使混合物均匀分布在孔中）。




6）放入培养箱继续培养。6 小时后，去除并更换 HEK293T 细胞包装培养基 2mL 。




7）按时用显微镜观察细胞生长状况或者荧光表达情况，并拍照取材。




8）RNA 提取，反转录成 c DNA。Real-time PCR 鉴定基因表达水平。




The surveyor assay of insertion and deletion分析 CRISPR/Cas9 系统在特定位点的作用效率




CRISPR/Cas9 系统在真核细胞中切割会造成 DNA 双链的断裂，我们采用 Dmitry Y.Guschin 等人用来分析 zinc finger nucleases (ZFN)造成的基因突变得方法来分析CRISPR/Cas9 系统作用效率。这种方法依赖于 Surveyor nuclease 的功能。将发生突变位点通过 PCR 将产物量放大，重新形成单链后退火使正常的序列与发生突变的序列形成错配，这种错配可以被 Surveyor nuclease 所识别并切开。通过这种方式可以很清楚的分析 CRISPR/Cas9 系统在特定位点的作用效率。




1）收集 HEK293T 细胞，1000 转离心 3 分钟，弃尽上清液，加入 PBS 将细胞重悬收集在 1.5mLEP 管内，用 PBS 洗一次。




2）取适量细胞 1000 转,3 分钟离心，弃尽上清液。




3）加入 PCR 裂解液（1000 个细胞/1μL PCR Lysis buffer）。




4）50℃，1 小时;95℃,15 分钟;4℃, 10 分钟。




5）PCR 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 是否有目的条带。




6) 退火：

3μL PCR 产物




6μL 1xBufferⅡ




95℃,5 分钟,95–85℃at –2◦C/s, 85–25ºCat –0.1℃/s; 4℃, 10 分钟。




7) 将产物放在冰上，加入 0.5μL Surveyor nucLease S 。




PCR 42℃，20 分钟;4℃, 10 分钟。




8) 加入 2μL 10×orange Loading buffer




9) PAGE 胶的配置

将洗干净并烘干的玻璃板用夹子夹住，固定在带有胶垫的架子上。上层胶和下层胶的组分如下：













10) 待胶凝固后，放在电泳槽中，加入 1×TBE,80V 电压,预跑 30 分钟。




11) 将 5μL 酶切好的样品点到点样孔中，使用 100bp DNA maker。




12) 80V 电压, 30 分钟; 120V 电压,90 分钟。




13) 把跑好的 PAGE 胶在玻璃板中取下，放在带有 EB 的 1×TBE 中，染色 10 分钟左右。




14) 凝胶成像，利用 ImageJ 软件进行灰度值分析。




PCR 产物送公司测序，进行 TIDE 分析（http://tide-calculator.nki.nl/）


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