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CRISPR/Cas9实验实操专题一：sgRNA设计
时间：2023-06-02 06:03:01 | 来源：网站运营
时间：2023-06-02 06:03:01 来源：网站运营
CRISPR/Cas9实验实操专题一：sgRNA设计：
CRISPR/Cas9实验流程1.sgRNA设计1.1设计原则
1） II型CRISPR系统（SpCas 9）的sgRNA 靶点一般为20nt
2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)
3）sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量为30%-70%
4）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高。
5）如果构建U6启动子或H1启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。
6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上，这可以保证蛋白尽可能多的功能域或结构域失效。
7)基因有多个转录本时尽量设计在各转录本的公共区域。
2.常用设计软件和设计流程
1）Broad Institute GPP
网址：
https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design2）Benchling
网址：
https://www.benchling.com/crisprBenchling和张锋实验室设计网站都是比较全面和权威的sgRNA设计网站，以人源TP53基因为例介绍Benchling设计流程。
1.首先登录
https://www.benchling.com/crispr网站，邮箱姓名注册账号。
2.点击左侧第二栏创建一个sgRNA文件。
3.点击左侧第四栏“+”，选择DNA sequence，点击import DNA sequence，点击or choose file，导入DNA序列snapgene文件。
4.通常选择靠近ATG的第一外显子设计sgRNA靶点，点击右侧“+”点击DESIGN ANDANALIZE GUIDES设计 konck on靶点，下方DESIGN HR TEMPLATE 是设计konck in靶点。
5.选择设计类型（单靶点，多靶点），靶点长度（默认20bp），物种，PAM序列。
6.选择一号外显子区域1-74bp，点击右侧create。
7.共设计出8个靶点，Cut Position表示位置，Strand表示靶向的是正以链或反义链，以及靶点20bp序列，PAM序列，On-Target靶向靶点和Off-Target脱靶评分，综合选择两个评分相对较高的靶点保存到sgRNA文件夹或导出序列。如果需要构建载体可以选中靶点，点击Assemble。
8.选择载体，点击Next。
9.选择保存位置，点击Assemble。
10.选择1号和2号靶点的FWD和REV引物序列到公司合成，退火后连接到载体上即可。
通常我们针对一个靶基因设计4-5条sgRNA，在其中筛选出1-2条活性较高的sgRNA，进行后续实验。
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