sgRNA设计工具，让基因编辑不再高冷！

时间：2023-06-02 12:09:01 | 来源：网站运营

时间：2023-06-02 12:09:01 来源：网站运营

sgRNA设计工具，让基因编辑不再高冷！：CRISPR/Cas9已经成为最常用的基因编辑系统。CRISPR/Cas9包括2部分：Cas9核酸内切酶和sgRNA(single guide RNA)，sgRNA由天然的tracrRNA (transactivating crRNA)和crRNA (CRISPR RNA)融合而来。

使用CRISPR/Cas9工具进行基因敲除等基因编辑时，首先要进行sgRNA设计。理论上只要根据PAM序列(SpCas9识别的最佳PAM是5-NGG-3)对所需靶向的物种基因组进行扫描，即可设计所有可能的sgRNA。但如何设计合理有效的sgRNA则需要谨慎考虑，因为这将决定其基因编辑结果。

图1 CRISPR/Cas9系统[2]




随着近年来研究的不断深入，研究者对CRISPR/Cas9系统机制已有非常全面的了解。这些研究结果也促进了大量的sgRNA设计工具的出现[1,3]，从而给研究者提供了快速、高效的sgRNA设计选择。

sgRNA的5’包括20nt的protospacer序列，该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割；其3’则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffold sequence)，该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex, RNP)。一般sgRNA序列大多指20nt的protospacer序列。

大部分的sgRNA设计工具，除展示设计序列外，主要包括效率和特异性评价，并给出参考评价分值。而不同工具所基于的数据和算法，导致给出特异性和效率结果可能不同。由于sgRNA特异性主要取决于是否存在潜在的错配序列，不同工具间结果一致性往往较高；但是对于效率预测，目前并没有非常成熟的预测工具，研究者使用时需要谨慎参考。

在工具设计页面上，不同的工具偏重点不同。很多工具提供不同的物种基因组序列，可使用基因ID直接获得sgRNA；或者通过输入候选序列进行sgRNA设计。并且大都能提供多种CRISPR/Cas系统以供设计。




下面简单介绍几种sgRNA设计工具：

Broad Institute GPP

(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)

较早出现的sgRNA在线设计工具，主要基于Doench等人2篇非常全面深入的sgRNA设计优化研究[4,5]，以提供最高效率和最小脱靶可能的sgRNA设计。

该工具可应用于CRISPRko，CRISPRa(CRISPR activation)和CRISPRi(CRISPR interference)的sgRNA设计。提供包括SpCas9、SaCas9、AsCas9和enAsCas9四种CRISPR工具，以及human、mouse和rat三种物种基因组设计选择。该工具可以通过序列直接输入、基因ID和序列文件导入进行设计。大部分在线工具同时能提供在线展示和下载。但该工具设计结果需要下载，不提供在线的结果展示。







http://crispr.mit.edu(R.I.P)




曾经最为广泛使用的sgRNA设计工具(已于2017关闭)。提供WT和nickases两种Cas9的sgRNA设计。其优点是通过算法预测，对设计的sgRNA给出高、中、低三个可用等级便于使用者快速选择。其页面设计能快速浏览sgRNA的潜在脱靶位点，非常受研究者喜爱。

一个致命问题是该工具过滤了重复序列区域(repeat region)，这样如果你的sgRNA序列在基因组上存在多个重复，该工具并不能提醒。




Deskgen

(https://www.deskgen.com/landing/#/)

随着CRISPR/Cas9的服务提供商的兴起，一些企业推出的sgRNA设计工具也非常具备使用性，并且这些工具往往贴合基因编辑设计，提供体验良好的可视化页面(比如：synthego,IDT, deskgen)。

其中DESKGEN AI是通过人工智能算法的设计工具，属于较为主流的CRISPR基因组编辑设计商业工具。




CRISPR finder

(https://www.sanger.ac.uk/htgt/wge/find_crisprs)

最大的特点和优势是可通过ensembl数据库的基因页面上显示sgRNA位置，提供基因组标注sgRNA浏览。便于快速的选定基因组的sgRNA序列。使用filter可快速选择不同等级的sgRNA显示。




crisprgold

(https://crisprgold.mdc-berlin.de/index.php)

该工具独特的提出一个关于sgRNA活性的见解[9,10]，如果protospacer和scaffold序列存在一定的互补，则会产生binding energy，则可能影响正常的sgRNA二级结构，从而影响对靶序列的识别和结合，该工具将这一因素考虑在内，进而可以提供活性更高的sgRNA设计。。

DeepHF

(http://www.deephf.com/index/#/Predict)

通过测试人全基因组8万多个sgRNA的细胞系水平活性效率[6]，在此数据基础上利用深度学习的方法建立了sgRNA效率的预测模型。与已有的模型相比，具有更准确的预测效果。

但值得注意的是，该模型数据来源于人的细胞系，可能并不适用于如小鼠或其他物种预测。




inDelphi和 FORECasT

(https://indelphi.giffordlab.mit.edu/)

(https://partslab.sanger.ac.uk/FORECasT#results)

以往认为，CRISPR/Cas9在无模板的情况下，通过NHEJ产生的修复结果是随机的indel。但近年多篇研究发现，同一靶点的sgRNA序列存在比较一致的修复结果(indel)，更进一步的发现，一部分的sgRNA的修复结果(the outcome of CRISPR-mediated editing)是可以预测的[7,8]。inDelphi和FORECasT是最近出现的sgRNA无模板编辑预测工具，这对研究者准确设计和使用sgRNA，以得到预期基因编辑目的提供的进一步帮助。




当前众多的sgRNA设计工具几乎都是通过大规模的实验数据集和系统分析，建立相应的模型或算法。随着更多CRISPR / Cas9数据集的出现，以及结合人工智能和深度学习算法，后续有望出现更多大数据集合、算法优化的设计工具。




参考文献

[1]Cui,Yingbo, et al. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools.Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences 10.2 (2018): 455-465.

[2]Graham, Daniel B., and David E. Root. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology 16.1 (2015): 260-260.

[3]Lee, Ciaran M., Timothy H. Davis, and Gang Bao. Examination of CRISPR/Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology 103.4 (2017): 456-460.

[4]Doench, John G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology 34.2 (2016): 184-191.

[5]Sanson, Kendall R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications 9.1 (2018).

[6]Wang, Daqi, et al. Optimized CRISPR guide RNA design for two high-fidelity Cas9 variants by deep learning. Nature Communications 10.1 (2019): 1-14.

[7]Shen, Max W., et al. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants.. Nature 563.7733 (2018): 646-651.

[8]Chakrabarti, Anob M., et al. Target-Specific Precision of CRISPR-Mediated Genome Editing. Molecular Cell 73.4 (2019).

[9]Chu, Van Trung, et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113.44 (2016): 12514-12519.

[10]Graf, Robin, et al. sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Cell Reports 26.5 (2019).