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只需5步，快速学会CRISPR/Cas9的sgRNA设计
时间：2023-06-02 08:39:02 | 来源：网站运营
时间：2023-06-02 08:39:02 来源：网站运营
只需5步，快速学会CRISPR/Cas9的sgRNA设计：CRISPR/Cas9可以说是近几年来生物医学领域最火的技术了，自2013年诞生以来就光芒四射，给生物医学领域带来巨大冲击，CRISPR/Cas9相关的科研成果频频登上顶尖期刊，国内CRISPR/Cas9相关的研究也是如火如荼。
CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计crRNA和tracrRNA这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
使用CRISPR/Cas9编辑基因成败的关键就在于sgRNA，在线设计sgRNA的网站有很多，本文重点推荐并介绍一个功能丰富，操作非常简单的站点
http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/，整个设计过程只需5步。
点击文末“阅读原文”下载PDF版设计教程。第一步选择基因编辑类型（敲除，抑制或激活基因表达等），本文以敲除为例（图1）。
图1.选择基因编辑类型
第二步输入基因序列（以人的MYC外显子2基因为例）
输入的基因序列的格式是raw 或 fasta，序列长度为< 10000bp（图2）
图2.输入基因序列
第三步选择spacer长度，开始扫描（图3）
选择spacer的长度，以19nt为例，点击scan按钮即可直接出现该基因序列上（正反链）所有可能的sgRNA的序列，开始和结束位点，分数，以及正反链。
图3.扫描基因正反链所有sgRNA
第四步导出文件（图4），点击下方Export to file即可导出所有sgRNA信息的文件
图4.导出并保存文件
第五步打开文件，挑选合适的sgRNA（以正链为例）（图5）
在Score这一列显示每一条sgRNA的敲除效率分数，分数越高敲除效率越高。但是这些的sgDNA位置有一些并不总在ATG的下游，所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择CDS区ATG下游通常100aa以内范围的sgRNA。（比如图4中的6较下游同时分数较高的）。
图5.挑选合适的sgRNA
一般针对一个基因选择3到6条sgRNA，选择合适的sgRNA后便可以克隆载体上了。
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